化学降解法

时间:2023-02-21 作者:admin
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Maxam-Gilbert 化学降解法1977年,A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法。

  • 中文名称 化学降解法
  • 外文名称 chemical degradation method

  来自即 Maxam-Gilbert 化学降解法1977年,A.M.Maxam和W.Gilbert首先建错号设呼刑核八证些条命立了DNA片段序列的测定方法,其原理为:将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记,再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基(表6-1),从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DNA片段,这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离,再经放射360百科线自显影,确定各片段末端碱基,从而得出目的DNA的碱基序列。Maxam-Gilbert化学降解法测序原理如图《化学降解法测序原理》所示:

化学降解法测序原理
Maxam-Gil观阻额亲团混义右加bert化学降解法测序的常用化学试剂

  碱基体

  化学修饰 试剂

  化学反

  断裂部位

  G

  A + G

  C + T

  C

  A > C

  dimethyl sulphate(硫酸二甲酯)

  Piperidine formate(哌啶 甲酸), pH2.0

  hydrazine(肼,联氨NH2.NH2)

  hydrazine + 怎领采话胡NaCl(1.5M)

  视星引候回渐冷呼运开水90°C, NaOH(1.2M)

  甲基化

  脱嘌呤

  打开嘧啶环

  打开胞嘧啶环

  断裂反

  G

  G和A

  翻希歌C和T

  C

  A和C

  酸二甲酯[dimethyl sulphate ,DMS ,两证福在异停鱼切持路(CH3 O)2 SO2 ]是一种碱性化学试剂,可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N7 甲基化,但是鸟嘌呤 G 的 N7 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍,并且在中性 pH环境中, DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ,使之甲基化,导致糖苷键断裂。

  哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解,导造就概县设门每致 DNA 链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。

  肼,又称联氨 NH2 .NH2 ,被岩画输造掌多月在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置,导致糖苷键断响席华广必为手裂。如果加入高浓度的盐(1.2M NaOH),肼则主要作用于胞嘧啶 C ,使之断裂。

  作为标记用的放射性同位素主要有 γ- P([γ- P]ATP,[γ- P]GTP. [γ- P]TTP ,或[γ- P]CTP),或 γ- NTP , S- NTP 。

  Ma担示打都进述血xam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应,因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差;对扬常对机甲杀风未经克隆的 DNA 片段可以直接测序;化好帝当久学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G , C 含量较高的 DNA 片段,以及短链的寡核苷酸片段放依买黑的序列。

  化学降解测序法承办采于叫后日既可以标记 5'-末端,继掉坐倍速审满始脚还也可以标记 3'-末端。如源题远国刻预品陈果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列,相互参照测定结果,可以得到准确的 DNA 链序列。

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